The Genetic Scissors Bring Life Sciences to a New Era: the Nobel Prize in Chemistry 2020

   瑞典皇家科学院10月7日宣布，将2020年诺贝尔化学奖授予法国科学家埃马纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）和美国科学家詹妮弗·A·杜德纳（Jennifer A.Doudna），以表彰她们在新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9研究领域作出的开创性贡献。这是诺贝尔奖史上首次由两位女性双双获得同一奖项，更为诺贝尔奖增添了一抹绚丽的色彩！

   细菌像一个智能的生物机器，为适应生存环境，它通过与抗原物质接触所产生的一种适应性（免疫）防御系统（adaptable defence system）——成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR关联因子（CRISPR associated，Cas），可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。对于细菌来说，这是从源头清除病毒感染的好方法。正是这套细菌的“免疫系统”，让生物学家看到了精准切割DNA的希望！CRISPR-Cas-9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，它作为一把能高效地更改生命密码的“基因剪刀（genetic scissors）”，已在各个领域崭露头角。

1. CRISPR/Cas系统的发现

   30年前，一位正在完成博士论文的年轻人Francisco Mojica来到了圣波拉海滩，在分析上古细菌（H.mediterranei）的DNA序列时，他观察到了一个有趣的现象——这些微生物的基因组里，存在许多奇怪的“回文”片段。对于这种具有规律性的重复片段，Mojica称之为“成簇规律间隔短回文重复序列”（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），而另一个简短的名称，即由各个词头构成的CRISPR，则读起来很上口。Mojica推断，如果两种有着巨大差异的微生物细胞中都有这种奇怪的序列，就说明它肯定有着某种特殊的功能。在成立了自己的实验室后，他发现在另外20多种微生物中同样具有CRISPR序列。然而，这种奇怪序列的功能却迟迟未能阐明。

   事实上，CRISPR的首次报道是在1987年。日本学者Yoshizumi Ishino的研究小组在分析大肠杆菌基因iap及周边序列时，偶然发现了一段位于该基因3’端存在的重复序列，其中含5个长29个碱基对（bp）的高度同源序列，它们与一段不保守但等长的32 bp序列间隔排列。由于实验技术所限，Ishino当时并没有对CRISPR序列进行深入的研究。

   2002年，荷兰学者Ruud Jansen等利用生物信息学分析并发现了Cas（CRISPR-associated）蛋白：它存在于含有CRISPR结构的原核基因组中，总是位于CRISPRs的邻近位置。Jansen与Mojica将该组合命名为CRISPR/Cas系统（CRISPR-Cas system）。该系统分为两类，Ⅰ型依赖于多个Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ型系统仅靠1种Cas蛋白发挥作用。

   随后的的几年间，Mojica（2005年）等3个独立的小组通过生物学信息分析证明CRISPR间隔（spacer）序列是来自外源入侵的DNA，他们推测这种spacer可能对外源DNA具有防御作用。Moineau小组（2010年）对嗜热链球菌（S.thermophilus）Ⅱ型CRISPR/Cas-9系统进行研究，确定了该系统在外源双链质粒DNA上精确的切割位点，而Cas-9是介导靶序列切割所需的唯一蛋白。

2. tracrRNA在crRNA成熟过程中的作用

   2011年，德国马克思·普朗克病原体科学研究所主任Charpentier的研究团队在利用化脓性链球菌(S.pyogenes)研究前CRISPR衍生的RNA（pre-CRISPR-derived RNA,pre-crRNA）和成熟crRNA分子的表达时，意外发现了1个活性CRISPR位点，并且在这个位点上游210 bp处有1个高表达的未知RNA分子，即后来被确认的反式编码小RNA（trans-encoded small RNA，tracrRNA)。tracrRNA分子内含25个核苷酸(nt)，与CRISPR位点的重复区域几乎完全互补。她们预测，其可能与前crRNA的碱基配对，将形成包括tracrRNA/pre-crRNA加工位点的2个RNAs协同加工。tracrRNA基因座缺失将阻止pre-crRNA双链RNA的加工，反之亦然。研究团队还发现，当tracrRNA/pre-crRNA双链共同加工时将得到短的3’突出端，而内切核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）负责tracrRNA/pre-RNA双链的加工。加工过程需要Cas-9蛋白的存在，缺失cas-9基因将破坏tracrRNA/pre-crRNA的加工过程。Cas-9蛋白相当于一个分子锚，促使tracrRNA/pre-crRNA之间的碱基配对，继而被宿主RNaseⅢ识别和裂解。

3. 细菌的获得性防御系统

   事实上，tracrRNA是细菌免疫防御系统CRISPR/Cas的一部分，该系统通过切割噬菌体DNA而解除其武装，从而抵抗噬菌体入侵细菌。整个过程大体分为以下3个步骤：（1）适应（adaptation）：CRISPR/Cas系统识别出入侵病毒的“名字”原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM），登记它的“身份证”原间隔序列（protospacer），把入侵者身份信息(spacer序列)作为“档案”，存档到“名单”（CRISPR）序列中，完成外源DNA俘获；（2）crRNA成熟（crRNA maturation）：由crRNA、Cas(Cas-9)和tracrRNA组成的复合物形成最终的防御系统。此复合物将根据入侵病毒的类型，选取对应的spacer序列RNA，并在RNaseⅢ的协助下对这段序列进行剪切。最终产生一段短小的成熟crRNA(包含单一种类的spacer RNA序列和部分重复序列区）；（3）干扰（interference）：这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的protospacer。最终，Cas-9使外源DNA双链断裂，破坏入侵病毒，完成靶向干扰。

4. 将sgRNA和Cas-9蛋白嵌合起来——基因编辑的雏形

   2011年，Charpentier与在RNA领域研究经验丰富的生物学家Doudna组成团队，合作鉴定出tracrRNA的2个关键功能。这2个关键功能是启动RNaseⅢ对pre-crRNA的加工，激活Cas-9蛋白对crRNA引导的DNA裂解。团队通过体外细胞实验发现，在纯化的Cas-9蛋白中添加crRNA并不能刺激Cas-9催化靶DNA的裂解，而如果加入tracrRNA则触发Cas-9对靶DNA的裂解。

   在Cas-9蛋白催化的protospacer裂解中，其特异性是由crRNA序列决定的。那么，tracrRNA对目标DNA序列的特异性切割是否有同样重要的作用呢？组合团队一起完成了这项工作。她们终于找到了Cas-9蛋白催化活性所必需的tracrRNA和crRNA区域，同时还在tracrRNA中成功地鉴定了一个活性识别区域，确认在目标链PAM近端区域（约为10 nt）对于识别尤为重要的“种子区(seed region)”。研究人员认为，Cas-9复合体的2个RNA成分(crRNA和tracrRNA)可以嵌合在一起，形成有活性的单导RNA(single-guide RNA,sgRNA)分子。嵌合的sgRNA序列可以改变，从而使CRISPR/Cas-9能够靶向目标DNA序列，只有靶DNA附近的PAM序列是唯一的限制。至此，她们巧妙地重建这把“基因剪刀”并将sgRNA和Cas-9蛋白双分子成分进一步简化。她们的研究表明，将这两个蛋白嵌合起来足以使靶DNA裂解，再通过编程，可实现对任意DNA序列的切割。

5. CRISPR/Cas-9介导的基因编辑机制

   Cas-9蛋白本质上是一种由RNA引导靶向切割目的基因的核酸内切酶，它含有HNH和RuvC 两个结构域，分别剪切DNA的2条单链。在Cas-9蛋白行驶切割功能时，Cas-9蛋白首先和crRNA及tracrRNA结合成复合物，crRNA引导复合物结合到目的序列上，然后Cas-9蛋白通过识别PAM序列打开DNA双链结构并结合DNA，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。随着基因编辑技术的发展，CRISPR/Cas-9系统被应用于哺乳动物细胞内进行DNA切割，导致细胞内双链DNA的断裂，引起细胞的非同源末端连接（nonhomologous end joining,NHEJ），产生小片段的插入或者缺失（insertions or deletion, indels），最终实现把基因敲除的目标。图1是CRISPR/Cas-9识别和靶向裂解DNA的模式图。

6. CRISPR/Cas9技术在高等细胞中的应用

   迄今为止，该系统还被用于在许多其他真核生物系统中引入基因组修饰，包括酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽隐线虫、斑马鱼和拟南芥，显示了其广泛的适用性。

   目前，科学家们正试图扩大CRISPR/Cas系统在基因组编辑中的作用。除了来自S.pyogenes的Cas-9蛋白，许多其他Cas同源物被用于基因组编辑和相关目的。天然的CRISPR系统有PAM需求和限制，然而Cas-9新变体的设计将改变PAM的兼容性，改变其酶切活性。用于更精确的同源重组和内源基因表达、激活和抑制。除了DNA，CRISPR/Cas系统也可用于靶向RNA。利用这把“剪刀”可以对动物、植物和微生物的DNA进行有目标性的编辑加工（剪切、删除、位移和替换等），从而治疗疾病，尤其是遗传病，并且获得人们想要的作物和生物产品。

   人们对CRISPR/Cas-9技术的研究速度和应用前景怀有无限的憧憬，但对它的应用会不会引发伦理和社会问题仍保有疑虑。需要强调的是，这项技术要以负责任的方式进行科学的管理和使用。